Já imaginou ou parou para pensar em como é feito o diagnóstico do câncer? É notório que quando o a determinação diagnóstica é confirmada, a pior parte é dar a notícia ao paciente. Sendo assim, para a descoberta de tal doença maléfica emprega-se a técnica de imuno-histoquímica. Portanto, após a biópsia, a requisição médica para mensurar a atividade cancerígena deverá ser feita o mais rápido possível.

Assim, quanto mais rápido for o diagnóstico mais rápido será o tratamento do paciente alcançado a cura com uma maior taxa de probabilidade.

Disciplina que aborda a imuno-histoquímica

A anatomia patológica é uma ciência derivada da medicina e da patologia com a finalidade de diagnosticar lesões a nível estrutural. A sua especialidade consiste na análise crítica e criteriosa dos tecidos enviados ao laboratório. Sendo assim, por ser uma área da patologia, se estuda as estruturas desde o nível microscópico até o macroscópico.

Portanto, considerada uma área de fundamental, visto que, a partir dessa ciência que se obtêm os laudos, desde as doenças até o atestado de óbito. Logo, veremos mais adiante sobre essa área da anatomia patológica.

Saiba os conceitos básicos de biópsia.

Conceito de imunohistoquímica

A imuno-histoquímica (IHQ) combina anatomia patológica, imunologia e bioquímica. Desse modo, baseia-se na conjugação de distintos marcadores, com moléculas de imunoglobulina. Sendo assim, com auxílio de um substrato específico localiza o antígeno tecidual.

Atualmente há disponibilidade de grande número de anticorpos para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina. Portanto, permite o estudo de blocos arquivados por longos períodos.

A técnica de IHQ mais usada é a indireta, associada ao complexoavidina-biotina-enzima. 

Desse modo, o complexo, formado pela ligação de uma molécula de strepto-avidina com várias de biotina associadas a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina). Desse modo, têm como função a conversão de um cromógeno incolor em um produto final que pode conferir diversas cores aos antígenos teciduais marcados. Portanto, as cores mais comuns são a castanha (peroxidase+ diaminobenzidina-DAB) e a vermelha (fosfatase alcalina + fast red).

Mecanismo de ação da imuno-histoquímica

O mecanismo básico da imuno-histoquímica dar-se pelo reconhecimento do antígeno a ser pesquisado por um anticorpo específico, associado a diversos tipos de processos de visualização. Desse modo, cada anticorpo reconhece apenas um único antígeno. Sendo assim, pode ser, por exemplo, uma proteína de uma célula normal, ou neoplásica ou de um microrganismo. Logo, a técnica usual utiliza um anticorpo secundário, que se liga ao anticorpo primário. Desse modo, associado a um complexo de visualização (complexo avidina-biotina-enzima-cromógeno ou polímero com amplificação).

O cromógeno mais utilizado é o DAB (diaminobenzidina) que confere cor marrom ao precipitado permanente. Logo, as áreas “reagentes” coram-se de marrom e as “não reagentes, com o corante utilizado para contra-coloração, geralmente a hematoxilina (azul).

Atualmente há disponibilidade de grande número de anticorpos primários para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina. Sendo assim, permite que o exame imunohistoquímico de biópsias, peças cirúrgicas e de necropsias arquivados por muitos anos (até mais de um século!). Portanto, preparados citopatológicos também podem ser utilizados nos exames imunohistoquímicos.

Aplicações

Em diversos casos é necessário utilizar o exame imunohistoquímico, procedimento sensível de detecção molecular. Desse modo, pode pode auxiliar no diagnóstico de doenças inflamatórias, infecciosas e neoplasias. Ou ainda fornecer dados mais precisos e individualizados sobre o melhor tratamento e provável evolução do câncer.

Principal utilização da imuno-histoquímica

Os marcadores tumorais realizados, solicitados pelo médico patologista. Desse modo, esse seleciona a lâmina do tumor da qual ele julga necessário para realizar imunohistoquímica. Sendo assim, realizados novos cortes do bloco de parafina correspondente à lâmina solicitada (preferencialmente de 2 a 3 micras). As lâminas usadas em IHQ, são silanizadas  (o silano é uma substância química destinada a formação de uma camada compatível entre o corte e a lâmina e facilita a fixação do esfregaço). Portanto, cada lâmina corresponde apenas a um marcador tumoral.

Inicio da rotina

As lâminas, serão colocadas no carrinho na ordem correspondente ao mapa de trabalho, em seguida devem ser colocadas na estufa a 60°C por até 12 horas. Sendo assim, passado o tempo as lâminas retiradas da estufa e mergulhadas no xilol e álcool absoluto na seguinte ordem:

Obs: todos as cubas de xilol devem ter a mesma concentração, as de álcool podem ter a mesma concentração ou hidratações progressivas (70%, 50%, 30%).

Em seguida as lâminas serão bem lavadas em água corrente, com cuidado para água não “cair” no esfregaço. Em seguida, depois mergulhadas várias vezes em cuba com água destilada.

Na continuação do processo seguinte consiste em colocar as lâminas em solução de citrato, esta solução, levada para o fogo até atingir a temperatura de mais ou menos 120° C. No entanto, pode-se colocar em panela de pressão e quando atingir a pressão contar 4 minutos, desligar a panela e deixar esfriar em banho de água corrente. Portanto, o citrato em alta temperatura tem a finalidade de “quebrar” as ligações de formol contidas no material. Depois as lâminas, lavadas em água corrente e também em água destilada.

Em seguida mergulhar os carrinhos em solução de água oxigenada destilada 10 volumes. A água oxigenada tem a finalidade de bloquear a peroxidase endógena do tecido e isso minimiza a coloração de fundo ou reações inespecíficas, facilitando a interpretação do resultado. Logo após, dar vários banhos de água corrente e depois lavar em água destilada e em seguida mergulhar as lâminas em PBS (solução tampão).

Preparo dos anticorpos para imuno-histoquímica

Identificar os tubos de ensaio com o  número do paciente e o nome do  anticorpo  correspondente. Desse modo, adicionar aos tubos  solução de PBS + anticorpo (que deve ser diluido conforme descrição do fabricante) e pingar na lâmina correspondente. Deixar incubando em geladeira “over night”.

Sendo assim, no dia seguinte tirar da geladeira e mergulhar três vezes em PBS (PH 7,4) pingar anticorpo secundário, mergulhar novamente três vezes PBS, pingar a Estreptoavidina Peroxidase e fazer  revelação com o DAB.

Portanto, depois de terminado o processo, deve-se contra-corar as lâminas para melhorar a visualização (Hematoxilina de Gill por 3 min), desidratar novamente as lâminas com Álcool Absoluto (2x 5 min cada) e Clarear com Xilol (2x por 5 min) e após, montar em bálsamo do Canadá.

Marcadores na imuno-histoquímica

• Actina muscular (HHF35): reconhece os isômeros alfa e gama das actinas musculares, mas não as actinas não musculares.
• CD3, células T: molécula ligada ao receptor de célula T, para demonstração de diferenciação de células T.
• CD20, células B: marcador de células B, mas não reagente para células B diferenciadas em plasmócitos.
• Citoqueratinas (AE1/AE3): demonstração da natureza epitelial de tumores morfologicamente indiferenciados.
• Receptores hormonais: hormônios, marcados de forma satisfatória, sendo úteis na caracterização de neoplasias endócrinas e neuro-endócrinas.
• Ki-67 (MIB-1): melhor marcador de proliferação celular;
• Produtos de oncogenes (C-erbB-2 e P53): usualmente marcadores de mau prognóstico.
• PSA (antígeno específico da próstata): marca o epitélio prostático normal e os carcinomas dele derivados.

Algumas aplicabilidades

A imunohistoquímica pode auxiliar em diversas situações. Para tanto, veremos adiante as suas principais aplicabilidades relacionadas a anatomia patológica e sua vasta gama de conhecimento.

Diagnóstico de tumores indiferenciados

Algumas vezes o exame histopatológico não consegue definir se um tumor é um carcinoma, linfoma, melanoma ou sarcoma. Desse modo, como cada tipo de tumor tem um tratamento e evolução diferente, é importante tentar diferenciá-los através da imunohistoquímica. Sendo assim, irá pesquisar moléculas associadas a diferentes tipos de tumor.

Diagnóstico diferencial entre tumores e estados reacionais

Alguns processos inflamatórios (reacionais) podem ser de difícil distinção com o câncer pelo exame histopatológico. Portanto, por exemplo: linfadenites x linfoma; alterações prostáticas benignas x câncer de próstata; doenças benignas X câncer de mama.

Diagnóstico de diversas doenças infecciosas

Por vezes é difícil determinar o agente etiológico de doenças infecciosas, particularmente os vírus. Sendo assim, a imunohistoquímica pode identificar as moléculas produzidas por diversos agentes infeciosos, como o da toxoplasmose. Desse modo, também pode rastrear muitos vírus, como o Citomegalovírus (CMV), vírus de Epstein-Barr (EBV), Herpes simples tipos I e II, vírus das Hepatites B e C.

Determinação de fatores prognósticos de neoplasias

Alguns marcadores imunohistoquímicos podem ser utilizados para identificar o provável comportamento de uma determinada neoplasia. Portanto, como exemplo a oncoproteína p53 e o antígeno Ki-67 em carcinomas, linfomas e tumores cerebrais etc.

Determinação e/ou sugestão de sítio primário de adenocarcinoma

Alguns pacientes descobrem um adenocarcinoma sem sítio primário identificado clinicamente. Sendo asism, a imunohistoquímica pode sugerir o sítio primário mais provável e auxiliar na escolha do tratamento mais adequado, bem como conhecimento do prognóstico.

Determinação de fatores preditivos de neoplasias

Dentre outros marcadores imunohistoquímicos podem ser utilizados para identificar móleculas-alvo para tratamentos modernos e individualizados. Desse modo, beneficia os pacientes, como os receptores de estrogênio e progesterona e oncoproteína c-erbB2/Her-2-neu no câncer de mama, o CD20 nos linfomas, o EGFR e VEGFR em diversos tipos de tumores dentre outros.

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